Procedure

Procedure

Nadat een bloedmonster ontvangen is worden alle relevante gegevens die bij dit monster horen geregistreerd in onze database. In principe zijn dit de gegevens die op het afslagplaatje van de patiënt staan:

• naam, geslacht en geboortedatum
• adres
• patiëntnummer
• zorgverzekeraar en polisnummer
• naam huisarts
• naam en adres van de aanvrager

Het is van groot belang dat de gegevens vermeld op de buis exact overeenkomen met die op het aanvraagformulier.

Deze gegevens zijn niet alleen van belang om u een uitslag of tussenrapportage te sturen, maar ook om de laboratoriumverrichtingen met de Zorgverzekeraar financieel af te handelen.
Na registratie sturen wij u een bevestiging dat wij het bloedmonster hebben ontvangen en vermelden de gegevens die wij geregistreerd hebben. Mochten er gegevens ontbreken dan geven wij in de brief aan welke dat zijn.

Vervolgens wordt uit 10 cc volbloed DNA geïsoleerd met behulp van een DNA-extractie apparaat (AutopureLS van Gentra Systems). Het resterende bloed vriezen we 1 jaar in. Mocht de DNA isolatie mislukken of mocht het DNA op raken, dan kunnen we uit het ingevroren bloed weer DNA isoleren.

Voordat we met de “complexe” DNA-diagnostiek beginnen controleren we of de patiënt lid is van een bekende FH familie of dat er patiënten in ons bestand zitten met een identieke naam en een bekende LDL-receptor genmutatie. In dit verband is het belangrijk om van getrouwde vrouwen ook de meisjesnaam te kennen. Indien een relatie met een moleculair getypeerde patiënt mogelijk is, voeren we eerst een “enkelvoudige” bepaling uit, waarbij we meteen testen op de betreffende mutatie. Is dat niet het geval dan starten we de “complexe” diagnostiek: het bepalen van de volledige DNA sequentie van het LDL-receptor gen en van 2 exonen in het apolipoproteine B gen.

Het sequenceren vindt plaats op 18 DNA fragmenten (16 van het LDL-receptor gen en 2 van het apolipoproteine B gen) nadat deze fragmenten met behulp van PCR zijn geamplificeerd. DNA is dubbelstrengs en de basenpaarvolgorde wordt in beide strengen bepaald. Voor elke patiënt worden dus 36 reacties uitgevoerd: 18 “forward” en 18 “reverse”.(zie hier filmpje, 2.1 Mb)

De stappen voor het sequenceren zijn als volgt:
PCR van een specifiek fragment – opzuiveren van het PCR product – uitvoeren van de sequence reactie – opzuiveren van het reactiemengsel – elektroforese op een ABI 3730 automatische sequencer – lezen/analyseren van de sequenties.

In de basenpaarvolgorde die wij analyseren (7200 basenparen per patiënt) zijn ongeveer 50 neutrale varianten bekend. Dit zijn afwijkingen van de normale volgorde die geen nadelig effect hebben.
Elke patiënt heeft wel een paar van deze neutrale varianten.
Indien we een functionele afwijking, mutatie dus, vinden, dan bevestigen we de aanwezigheid van deze mutatie met een enkelvoudige analyse, als het een reeds bekende mutatie is. Betreft het een nog niet eerder gevonden mutatie, dan moeten we eerst een enkelvoudige analyse methoden ontwikkelen.

Op het moment dat een mutatie bevestigd is, sturen wij u een brief met daarin de uitslag. Vervolgens kunt u in de mutatiedatabase op deze site meer informatie vinden over de mutatie die wij bij uw patiënt hebben gevonden.

Indien sequencing geen functionele mutaties oplevert, sturen wij u een tussenrapportage om dit te melden. Vervolgens wordt een ander soort analyse (MLPA) toegepast om grote veranderingen (deleties en inserties) aan te tonen. In dit stadium is de kans om een mutatie te vinden minder dan 4%. Komt uw patient ook negatief uit de MLPA dan sturen wij u een eindrapportage. Wij houden wel het DNA in opslag om in een later stadium analyses uit te voeren voor het geval dat zich nieuwe ontwikkelingen voordoen.

naar boven